分子生物学

  分子生物学,是从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学。是一门生物学化学之间跨学科,其研究领域涵盖了遗传学、生物化学和生物物理学等学科。分子生物学主要致力于对细胞中不同系统之间相互作用的理解,包括DNA,RNA和蛋白质生物合成之间的关系以及了解它们之间的相互作用是如何被调控的。自20世纪50年代以来,分子生物学是生物学的前沿与生长点,其主要研究领域包括蛋白质体系、蛋白质-核酸体系 (中心是分子遗传学)和蛋白质-脂质体系(即生物膜)。  在1930年代,由于许多生物化学家发现细胞内的许多分子参与了各种复杂的化学反应,分子生物学由此逐步建立。但直到1938年“分子生物学”一词才由瓦伦·韦弗(Warren Weaver)提出(也有人认为“分子生物学”一词最早于1945年威廉·阿斯特伯里(William Astbury)首先在Harvey Lecture上应用的)。瓦伦是当时洛克斐勒基金会自然科学方面的主持人,他相信由于在X射线晶体学等方面的发展,生物学正在进入一个大的转变期,他也因此将基金会的资金用于资助生物领域的研究。

概述

1871年Miescher在脓细胞及鲑鱼精子细胞的核中分离出核质(nuclein,其实更正确的说法为核酸),这是最早有记录发现核酸的报告
  生物大分子,特别是蛋白质和核酸结构功能的研究,是分子生物学的基础。现代化学和物理学理论、技术和方法的应用推动了生物大分子结构功能的研究,从而出现了近30年来分子生物学的蓬勃发展。  分子生物学和生物化学及生物物理学关系十分密切,它们之间的主要区别在于:  1.生物化学和生物物理学是用化学的和物理学的方法研究在分子水平,细胞水平,整体水平乃至群体水平等不同层次上的生物学问题。而分子生物学则着重在分子(包括多分子体系)水平上研究生命活动的普遍规律;  2.在分子水平上,分子生物学着重研究的是大分子,主要是蛋白质,核酸,脂质体系以及部分多糖及其复合体系。而一些小分子物质在生物体内的转化则属生物化学的范围;  3.分子生物学研究的主要目的是在分子水平上阐明整个生物界所共同具有的基本特征,即生命现象的本质;而研究某一特定生物体或某一种生物体内的某一特定器官的物理、化学现象或变化,则属于生物物理学或生物化学的范畴。  分子生物学的研究者们不仅应用分子生物学特有的技术,而且越来越多地从遗传学、生物化学和生物物理学的技术和思路中获得启迪,综合利用。因此,这些学科间越来越多地相互融合,不再有明确的分界线。
生物化学、遗传学和分子生物学关系简图
  “生物化学”主要研究化学物质在生物体关键的生命进程中的作用。   “遗传学”主要研究生物体间遗传差异的影响。这些影响常常可以通过研究正常遗传组分(如基因)的缺失来推断,如研究缺少了一个或多个正常功能性遗传组分的突变体与正常表现型(又称为“野生型”)之间的关系。遗传相互作用(如异位显性)经常会使像基因敲除这类研究的结果难以解释。   “分子生物学”则主要研究遗传物质的复制、转录和翻译进程中的分子基础。分子生物学的中心法则 认为“DNA 制造 RNA,RNA 制造蛋白质,蛋白质反过来协助前两项流程,并协助 DNA 自我复制”;虽然这一描述对分子生物学所涵盖的内容过于简单化(特别是RNA的新功能仍在不断发现中),但仍不失为了解这一领域的很好的起点。 主条目:分子生物学的中心法则  在分子生物学中大量工作是定量的,而且最近的许多研究工作是在结合生物信息学和计算生物学的基础之上完成的。从本世纪(二十一世纪)开始,研究基因结构和功能的分子遗传学已经成为分子生物学中发展最快的领域之一。  越来越多的学科已经将目光集中到分子水平的研究中,一方面直接研究相关分子间相互作用,如细胞生物学和发育生物学;另一方面利用分子生物学技术来研究并推测群体和物种的历史贡献(非直接,遗传水平),如进化生物学领域中的群体遗传学和系统发生学。此外,生物物理学一直都有从头研究生物分子的传统。

发展简史

   结构分析和遗传物质的研究在分子生物学的发展中作出了重要的贡献。结构分析的中心内容是通过阐明生物分子的三维结构来解释细胞的生理功能。1912年英国 W.H.布喇格和W.L.布喇格建立了X射线晶体学,成功地测定了一些相当复杂的分子以及蛋白质的结构。以后布喇格的学生W.T.阿斯特伯里和J.D.贝尔纳又分别对毛发、肌肉等纤维蛋白以及胃蛋白酶、烟草花叶病毒等进行了初步的结构分析。他们的工作为后来生物大分子结晶学的形成和发展奠定了基础。50年代是分子生物学作为一门独立的分支学科脱颖而出并迅速发展的年代。首先是在蛋白质结构分析方面,1951年L.C.波林等提出了 α-螺旋结构,描述了蛋白质分子中肽链的一种构象。1955年F.桑格完成了胰岛素的氨基酸序列的测定。接着 J.C.肯德鲁和M.F.佩鲁茨在X射线分析中应用重原子同晶置换技术和计算机技术分别于1957和1959年阐明了鲸肌红蛋白和马血红蛋白的立体结构。1965年中国科学家合成了有生物活性的胰岛素,首先实现了蛋白质的人工合成。  另一方面,M.德尔布吕克小组从1938年起选择噬菌体为对象开始探索基因之谜。噬菌体感染寄主后半小时内就复制出几百个同样的子代噬菌体颗粒,因此是研究生物体自我复制的理想材料。1940年G.W.比德尔和E.L.塔特姆提出了“一个基因,一个酶”的假设,即基因的功能在于决定酶的结构,且一个基因仅决定一个酶的结构。但在当时基因的本质并不清楚。1944年O.T.埃弗里等研究细菌中的转化现象,证明了DNA是遗传物质。1953年J.D.沃森和F.H.C.克里克提出了DNA的双螺旋结构,开创了分子生物学的新纪元。在此基础上提出的中心法则,描述了遗传信息从基因到蛋白质结构的流动。遗传密码的阐明则揭示了生物体内遗传信息的贮存方式。1961年F.雅各布和J.莫诺提出了操纵子的概念,解释了原核基因表达的调控。到20世纪60年代中期,关于DNA自我复制和转录生成RNA的一般性质已基本清楚,基因的奥秘也随之而开始解开了。  仅仅30年左右的时间,分子生物学经历了从大胆的科学假说,到经过大量的实验研究,从而建立了本学科的理论基础。进入70年代,由于重组DNA研究的突破,基因工程已经在实际应用中开花结果,根据人的意愿改造蛋白质结构的蛋白质工程也已经成为现实。

基本内容

 

·蛋白质体系

   蛋白质的结构单位是α-氨基酸。常见的氨基酸共20种。它们以不同的顺序排列可以为生命世界提供天文数字的各种各样的蛋白质。  蛋白质分子结构的组织形式可分为 4个主要的层次。一级结构,也叫化学结构,是分子中氨基酸的排列顺序。首尾相连的氨基酸通过氨基与羧基的缩合形成链状结构,称为肽链。肽链主链原子的局部空间排列为二级结构。二级结构在空间的各种盘绕和卷曲为三级结构。有些蛋白质分子是由相同的或不同的亚单位组装成的,亚单位间的相互关系叫四级结构。  蛋白质的特殊性质和生理功能与其分子的特定结构有着密切的关系,这是形形色色的蛋白质所以能表现出丰富多彩的生命活动的分子基础。研究蛋白质的结构与功能的关系是分子生物学研究的一个重要内容。  随着结构分析技术的发展,现在已有几千个蛋白质的化学结构和几百个蛋白质的立体结构得到了阐明。70年代末以来,采用测定互补DNA顺序反推蛋白质化学结构的方法,不仅提高了分析效率,而且使一些氨基酸序列分析条件不易得到满足的蛋白质化学结构分析得以实现。  发现和鉴定具有新功能的蛋白质,仍是蛋白质研究的内容。例如与基因调控和高级神经活动有关的蛋白质的研究现在很受重视。

·蛋白质-核酸体系

   生物体的遗传特征主要由核酸决定。绝大多数生物的基因都由 DNA构成。简单的病毒,如λ噬菌体的基因组是由 46000个核苷酸按一定顺序组成的一条双股DNA(由于是双股DNA,通常以碱基对计算其长度)。细菌,如大肠杆菌的基因组,含4×106碱基对。人体细胞染色体上所含DNA为3×109碱基对。  遗传信息要在子代的生命活动中表现出来,需要通过复制、转录和转译。复制是以亲代 DNA为模板合成子代 DNA分子。转录是根据DNA的核苷酸序列决定一类RNA分子中的核苷酸序列;后者又进一步决定蛋白质分子中氨基酸的序列,就是转译。因为这一类RNA起着信息传递作用,故称信使核糖核酸(mRNA)。由于构成RNA的核苷酸是4种,而蛋白质中却有20种氨基酸,它们的对应关系是由mRNA分子中以一定顺序相连的 3个核苷酸来决定一种氨基酸,这就是三联体遗传密码。  基因在表达其性状的过程中贯串着核酸与核酸、核酸与蛋白质的相互作用。DNA复制时,双股螺旋在解旋酶的作用下被拆开,然后DNA聚合酶以亲代DNA链为模板,复制出子代 DNA链。转录是在 RNA聚合酶的催化下完成的。转译的场所核糖核蛋白体是核酸和蛋白质的复合体,根据mRNA的编码,在酶的催化下,把氨基酸连接成完整的肽链。基因表达的调节控制也是通过生物大分子的相互作用而实现的。如大肠杆菌乳糖操纵子上的操纵基因通过与阻遏蛋白的相互作用控制基因的开关。真核细胞染色质所含的非组蛋白在转录的调控中具有特殊作用。正常情况下,真核细胞中仅2~15%基因被表达。这种选择性的转录与转译是细胞分化的基础。

·蛋白质-脂质体系

   生物体内普遍存在的膜结构,统称为生物膜。它包括细胞外周膜和细胞内具有各种特定功能的细胞器膜。从化学组成看,生物膜是由脂质和蛋白质通过非共价键构成的体系。很多膜还含少量糖类,以糖蛋白或糖脂形式存在。  1972年提出的流动镶嵌模型概括了生物膜的基本特征:其基本骨架是脂双层结构。膜蛋白分为表在蛋白质和嵌入蛋白质。膜脂和膜蛋白均处于不停的运动状态。  生物膜在结构与功能上都具有两侧不对称性。以物质传送为例,某些物质能以很高速度通过膜,另一些则不能。象海带能从海水中把碘浓缩 3万倍。生物膜的选择性通透使细胞内pH和离子组成相对稳定,保持了产生神经、肌肉兴奋所必需的离子梯度,保证了细胞浓缩营养物和排除废物的功能。  生物体的能量转换主要在膜上进行。生物体取得能量的方式,或是像植物那样利用太阳能在叶绿体膜上进行光合磷酸化反应;或是像动物那样利用食物在线粒体膜上进行氧化磷酸化反应。这二者能量来源虽不同,但基本过程非常相似,最后都合成腺苷三磷酸。对于这两种能量转换的机制,P.米切尔提出的化学渗透学说得到了越来越多的证据。生物体利用食物氧化所释放能量的效率可达70%左右,而从煤或石油的燃烧获取能量的效率通常为20~40%,所以生物力能学的研究很受重视。对生物膜能量转换的深入了解和模拟将会对人类更有效地利用能量作出贡献。  生物膜的另一重要功能是细胞间或细胞膜内外的信息传递。在细胞表面,广泛地存在着一类称为受体的蛋白质。激素和药物的作用都需通过与受体分子的特异性结合而实现。癌变细胞表面受体物质的分布有明显变化。细胞膜的表面性质还对细胞分裂繁殖有重要的调节作用。  对细胞表面性质的研究带动了糖类的研究。糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂等生物大分子结构与功能的研究越来越受到重视。从发展趋势看,寡糖与蛋白质或脂质形成的体系将成为分子生物学研究的一个新的重要的领域。

技术

  从1950年代晚期和1960年代早期开始,分子生物学家已经开始学习鉴定、提纯和处理细胞和生物体的分子组分。这些组分包括:DNA,遗传信息的携带者;RNA,作为DNA的“近亲”,既可以是DNA的临时“工作拷贝”,又可以发挥结构分子和酶功能,同时还是蛋白质翻译的结构和功能元件;蛋白质,细胞中的主要的结构分子和酶分子。

·克隆表达

  分子生物学中最基本的技术是蛋白质的表达和纯化。首先是编码目的蛋白的DNA序列被克隆(用PCR技术和限制性内切酶)到作为表达载体的质粒中。随后构建好的质粒被引入到宿主细胞。编码序列在质粒上的特殊的启动子元件的驱动下,被宿主细胞的表达系统所表达。质粒上通常还带有抗生素抗性标签以便于质粒筛选。  质粒可以被插入到细菌或动物细胞。外源DNA被引入细菌被称为转化,可以通过电穿孔法、微注射法、正吸收和融合来实现;外源DNA被引入真核细胞,如动物细胞,被称为转染,转染技术包括磷酸钙法、脂质体法和一些有专利权的商用转染试剂。DNA也可以以病毒或病原菌为载体被带入宿主细胞;应用这种病毒或病菌的转染技术于细胞时,用术语来说就是“对细胞进行转导(transduce)”。

·多聚酶链式反应

  多聚酶链式反应(PCR)是一项用于体外复制DNA的极为通用的技术。简而言之,PCR技术可以使单链DNA被复制数百万次,也允许用事先确定好的方式对被复制的DNA序列进行改动。例如,PCR技术可以用于引入限制性酶切位点,或者对特定的DNA碱基进行突变(改变)。PCR技术还可以用于从cDNA文库获得特定的DNA片断,或者从另一个角度,用于判断一个cDNA文库中是否含有特定的DNA片断。

·凝胶电泳

  凝胶电泳是分子生物学最主要的一项技术。其基本原理是:DNA、RNA和蛋白质可以用电场来进行分离。在琼脂糖凝胶电泳中,DNA和RNA可以被琼脂糖凝胶按其分子大小进行分离。同样,蛋白质可以被SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)按分子量大小分离;此外,蛋白质还可以由于所带电荷的不同被等电聚焦电泳分离。

·墨点法

  南方墨点法 此方法的命名源自其发明者生物学家Edwin Southern。南方墨点法(墨点或称印迹)是探测一个DNA样品中含有特定DNA序列的方法。首先,DNA样品为凝胶电泳所分离;然后,分离的样品通过毛细现象被转移到一张膜上,这一过程被称为“印迹”(blotting)。带有样品的膜就可以用与目标序列互补的标记的DNA标记探针来探测。最初的操作手册大都采用放射性标记,但现在非放射性标记已开始被采用。自从PCR技术被用于检测特定DNA序列后,Southern印迹法在实验室中的应用大为减少。但此方法依然有着其他一些应用,如用于测量转基因鼠的转基因拷贝数,以及用于构建基因敲除的胚胎干细胞系。    北方墨点法 北方墨点法被用于研究特定类别的RNA分子的表达模式(丰度和大小)。与南方墨点法相似,RNA样品为凝胶电泳按大小分离;然后转移到膜上,并用与目标序列互补的标记的探针来探测。实验结果可以根据所用探针的不同以多种方式来观察,但大多数都显示的是样品中被探测的RNA条带的相对位置,也就是分子大小;而条带的强度则与样品中目标RNA的含量相关。这一方法可以测量目标RNA在不同样品中的情况,因此已经被普遍用于研究特定基因在生物体中表达的时刻和表达量,也是这类研究中最基本的手段。    西方墨点法 大多数蛋白的抗体可以通过将少量的蛋白注入动物(如鼠、兔、羊)以获得对应注入蛋白的抗体(多克隆抗体)或进一步通过细胞培养获得抗体(单克隆抗体)。这些抗体就可为许多分析和制备技术所使用。在西方墨点法中,蛋白质首先根据分子大小用SDS-PAGE分离。然后将胶中的蛋白质转移到膜(如PDVF膜、尼龙膜或其他可用的膜)上。然后将膜用含有抗体的溶液浸泡,由于抗体可以特异性地结合到目标蛋白上,因此就可以探测膜中的目标蛋白。同样观察结果的方法有很多,包括显色产物、化学发光(chemiluminescence)或放射自显影。一些与西方墨点法相似的方法可以用于直接对细胞和组织中的特定蛋白进行染色,然而这些被称为“免疫染色”的方法更多的是应用于细胞生物学而非分子生物学。  此外,还有并不常用的“东方墨点法”(对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析)、“西南方墨点法”(研究蛋白质和DNA相互作用)和“远端西方墨点法”(Far Western blotting,研究蛋白质-蛋白质相互作用)。  值得一提的是除了南方墨点法的命名是来自于发明者的姓名,其他墨点法的命名则都是源于发明者的幽默:因为南方(Southern)既是墨点法的发明者Edwin Southern的姓,同时其英文含义为“南方”;于是随后发明不同印迹法的研究者们纷纷将这些方法以方位命名,如Northern(“北方”),Western(“西方”)印等等。

·微阵列技术

  微阵列也可以用除了DNA以外的分子来制作。如抗体微阵列可被用于检测血液样品中含有哪些蛋白质或细菌。

理论意义和应用

   分子生物学的成就说明:生命活动的根本规律在形形色色的生物体中都是统一的。例如,不论在何种生物体中,都由同样的氨基酸和核苷酸分别组成其蛋白质和核酸。遗传物质,除某些病毒外,都是DNA,并且在所有的细胞中都以同样的生化机制进行复制。分子遗传学的中心法则和遗传密码,除个别例外,在绝大多数情况下也都是通用的。  物理学的成就证明,一切物质的原子都由为数不多的基本粒子根据相同的规律所组成,说明了物质世界结构上的高度一致,揭示了物质世界的本质,从而带动了整个物理学科的发展。分子生物学则在分子水平上揭示了生命世界的基本结构和生命活动的根本规律的高度一致,揭示了生命现象的本质。和过去基本粒子的研究带动物理学的发展一样,分子生物学的概念和观点也已经渗入到基础和应用生物学的每一个分支领域,带动了整个生物学的发展,使之提高到一个崭新的水平。  过去生物进化的研究,主要依靠对不同种属间形态和解剖方面的比较来决定亲缘关系。随着蛋白质和核酸结构测定方法的进展,比较不同种属的蛋白质或核酸的化学结构,即可根据差异的程度,来断定它们的亲缘关系。由此得出的系统进化树,与用经典方法得到的是基本符合的。采用分子生物学的方法研究分类与进化有特别的优越性。首先,构成生物体的基本生物大分子的结构反映了生命活动中更为本质的方面。其次,根据结构上的差异程度可以对亲缘关系给出一个定量的,因而也是更准确的概念。第三,对于形态结构非常简单的微生物的进化,则只有用这种方法才能得到可靠结果。  高等动物的高级神经活动是极其复杂的生命现象,过去多是在细胞乃至整体水平上研究,近年来深入到分子水平研究的结果充分说明高级神经活动也同样是以生物大分子的活动为基础的。例如,在高等动物学习与记忆的过程中,大脑中RNA和蛋白质的组成发生明显的变化,并且一些影响生物体合成蛋白质的药物也显著地影响学习与记忆的能力。又如,“生物钟”是一种熟知的生物现象。用鸡进行的实验发现,有一种重要的神经传递介质(5-羟色胺)和一种激素(褪黑激素)以及控制它们变化的一种酶,在鸡脑中的含量呈24小时的周期性变化。正是这种变化构成了鸡的“生物钟”的物质基础。  在应用方面,生物膜能量转换原理的阐明,将有助于解决全球性的能源问题。了解酶的催化原理就能更有针对性地进行酶的人工模拟,设计出化学工业上广泛使用的新催化剂,从而给化学工业带来一场革命。  分子生物学在生物工程技术中也起了巨大的作用,1973年重组DNA技术的成功,为基因工程的发展铺平了道路。80年代以来,已经采用基因工程技术,把高等动物的一些基因引入单细胞生物,用发酵方法生产干扰素、多种多肽激素和疫苗等。基因工程的进一步发展将为定向培育动、植物和微生物良种以及有效地控制和治疗一些人类遗传性疾病提供根本性的解决途径。