溶菌酶

溶菌酶
             溶菌酶
  溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramide glycanohydrlase),是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合,与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐,使病毒失活。因此,该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。
  该酶广泛存在于人体多种组织中,鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶,其中以蛋清含量最为丰富。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸,有4对二硫键维持酶构型,是一种碱性蛋白质,其N端为赖氨酸,C端为亮氨酸。可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。

发现

 
  英国细菌学家亚历山大·弗莱明在1922年首先发现了溶菌酶。发现人的唾液、眼泪中存在有溶解细菌细胞壁的酶,因其具有溶菌作用,故命名为溶菌酶。
  Alexander Fleming在寻找抗生素的过程中发现了溶菌酶。在试验的几年中,他向细菌培养物中加入所有想的到的物质,并观察哪些可以抑制细菌生长。一次偶然的机会,他发现了溶菌酶。一天,他患了感冒,就把一滴鼻粘液滴到培养物中,令他惊奇的是,鼻粘液竟然杀死了周围的细菌(这正是我们自身抗感染的天然屏障之一)。但是溶菌酶分子太大不能在细胞间运输,只能在局部起作用,故不能作为药物广泛使用。幸运的是,Fleming继续他的试验,终于在五年后发现了真正的抗生素药物:青霉素
  溶菌酶保护我们不受细菌感染。它是一个小分子酶,能破坏细菌的细胞壁。细胞壁是包裹在细菌外面的坚韧的外壳,由糖链构成,并且通过短的肽键交联起来,它保护细胞膜不被胞内高渗透压损伤。而溶菌酶能断裂细胞壁的糖链,从而破坏其完整结构,使细菌裂解死亡。

细胞守护者

鸡蛋清中的溶菌酶
   鸡蛋清中的溶菌酶
  溶菌酶在那些适宜细菌生长的部位起保护作用。右侧图片为存在于鸡蛋清的溶菌酶,它可以保护鸡蛋中为鸡胚生长发育提供营养的蛋白质和脂类。它是第一个被阐明结构的酶(蛋白质编号2lyz).我们的眼泪和鼻粘液中就含有溶菌酶,它帮助身体表面组织抵抗感染。但是在血液中,溶菌酶只能起到一定的保护作用。当血液受到感染,会把细菌带到身体各个部位,所以这里需要更强有力的免疫方法。

分子实验

  溶菌酶是一种小分子酶,结构稳定,是研究蛋白质结构和功能的理想典范。Oregen大学的Brian Matthews用溶菌酶进行了一系列出色的实验。他利用噬菌体在溶菌酶分子上构建了几百个突变。这些突变是将其肽链上一个或多个氨基酸替换成其它不同的氨基酸。他将蛋白质内部的几个大残基去掉,留下一个空穴,或者加入一个较大的氨基酸,结果发现蛋白质都不能正确装配。他试图通过创造新的分子模型来创造出新的活性位点。这几百个突变体的结构都可在HPDB中找到(实际上,溶菌酶是HPDB中最普遍的蛋白质)。这里所示的突变体有两个氨基酸(用绿色表示)被替换成半胱氨酸,两个半胱氨酸形成一个新的二硫键(用亮黄色显示)。图片中左侧为天然的溶菌酶分子,右侧则是突变体。

探索结构

  溶菌酶的分子表面有一个较深的裂缝,是其活性部位。它可与细菌细胞壁的糖链结合,使其中一个糖环变形,从而使糖链更容易断裂(但有的研究认为其他因素,如静电力,则起着更重要的作用)。下图所示的结构中包含了两个糖环及一段交联肽。在该结构中,显示出了被扭曲的环:正常的糖环是椅式构象(如图中右侧紫色环),扭曲了的环(左侧绿色环)则变平了一些,形成一种不稳定的“半椅式”构象,易于断裂。

种类及作用机制

  溶菌酶按其所作用的微生物不同分两大类,即细菌细胞壁溶菌酶和真菌细胞壁溶菌酶。真菌细胞壁溶菌酶包括酵母菌细胞壁溶解酶和霉菌细胞壁溶解酶。
  溶菌酶广泛地分布于自然界中,在人的组织及分泌物中可以找到,动物组织中也有,以鸡蛋清中含量最多。其它植物组织及微生物细胞中也存在。根据来源不同,其性质及作用机制略有差异。
  鸡蛋清溶菌酶 鸡蛋清溶菌酶占蛋清总蛋白的3.4%~3.5%,作为溶菌酶类的典型代表,是目前重点研究的对象,也是了解最清楚的溶菌酶之一。它由18种129个氨基酸残基组成,其分子量为14000,最适pH为6~7。在pH4~7、100℃处理1min不失活,是一种稳定的蛋白质。鸡蛋清溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖(细菌细胞壁的主要成份)。
  人及哺乳动物溶菌酶 人溶菌酶存在于眼泪、唾液、鼻粘液、乳汁等分泌液以及淋巴腺和白血球中,1ml眼泪中含7mg溶菌酶,1ml乳汁中含0.1~0.5mg。人溶菌酶由130个氨基酸残基组成,分子量为14600,其溶菌活性比鸡蛋清溶菌酶高3倍。 对于哺乳动物溶菌酶,目前仅从等动物的乳汁中分离出溶菌酶,其化学性质与人溶菌酶相似,但结构尚不清楚,其溶菌活性也远低于人溶菌酶约3000倍。人及哺乳动物溶菌酶的作用机制与鸡蛋清溶菌酶相同。
  植物溶菌酶 目前已从木瓜无花果芜菁大麦等植物中分离出溶菌酶,其分子量较大,约为24000~29100。
  微生物产生的溶菌酶 人们从60年代发现微生物也产生溶菌酶。

应用

·医学应用

  医学上应用可作为一种具有杀菌作用的天然抗感染物质。有抗菌、抗病毒、止血、消肿止痛及加快组织恢复功能等作用。临床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹和扁平疣等。也可与抗菌药物合用治疗各种细菌和病毒感染。口服和肌注均有效。口服,3~5片/次(肠溶片含10mg),3次/日。口含,1片/次(口含片含20mg),4~6次/日。外用:以1%~2%溶液滴注、涂擦或直接喷粉。肌注,50mg~100mg/次,1~2次/日。滴眼:用2%溶液。
  副作用 偶有较轻的过敏反应。氯化溶菌酶医疗效果更广,有浓痰分散、出血抑制、组织修复、消炎镇痛、抗过滤性病毒等作用,因而用氯化溶菌酶的制药有消炎消痔、治感冒、皮肤病及眼、鼻、喉等用药.

·食品保藏

  食品保藏应用可作为防腐剂,它的主要功用是水解细菌细胞壁,在细胞内,则对吞噬后的病原菌起破坏作用。该酶对革兰氏阳性菌中的枯草杆菌、耐辐射微球菌有分解作用。对大肠杆菌、普通变形菌和副溶血性弧菌等革兰氏阴性菌也有一定程度溶解作用,其最有效浓度为0.05%。与植酸、聚合磷酸盐、甘氨酸等配合使用,可提高其防腐效果。

医学研究

·溶菌酶在胃肠道的分布

  消化道含有大量酶类,这些酶多由胃肠道粘膜中的相应细胞产生和分泌。用免疫细胞化学研究酶的分布及含量改变对某些消化道疾病的病因和诊断有较大价值。近年来,对溶菌酶的研究较多。以往的研究认为溶菌酶是粒性白细胞所分泌。现在发现巨噬细胞、单核细胞和血清中含有溶菌酶。用免疫细胞化学染色发现胃肠道某些腺体细胞也能分泌,且在不同病变中出现不同分泌特点。

·溶菌酶的免疫细胞化学染色特点

  一、组织固定和加工
  用冰冻组织切片可直接进行溶菌酶免疫细胞化学研究。用冷酒精固定,4%福尔马林缓冲液或1.5%戊二醛固定均能进行免疫细胞化学染色。但浸蜡时温度不能超过60 ℃ ,载玻片应涂薄层明胶以防组织切片脱落。载片后,组织切片应放在50~56 ℃ 的烤箱中干燥但不能放在底层,因烤箱底层温度不均匀。组织切片应避免接触含油类的手和容器。组织块应放在4℃密闭容器内干燥保存。脱蜡一定要完全。
  二、染色方法的选择
  根据具备的抗体和标记抗体,免疫荧光和免疫酶技术均可采用。间接法、PAP法和ABC等方法均可以选择。大部分报道多采用冷冻切片和ABC染色方法。ABC方法特异性强,敏感性高,非特异性染色少。目前国内已有ABC试剂盒生产。普遍认为国外Vectastain 实验室生产的Vectastain Elite ABC kit试剂盒较好,其敏感性比Vectastain ABC peroxidase kit高5倍。如果加大第一个抗体的浓度,可进行快速染色,整个染色过程只需30min。如果要进行双标记染色,可在DAB显色液作用后组织切片再进行另一种抗体染色,最后在DAB显色液中加氯化镍,使阳性部位显示紫色。与DAB显示红棕色比较,反差明显。
  三、ABC染色步骤
  叠氮钠能抑制过氧化酶活性,不宜用以稀释ABC试剂盒中的试剂。第一抗体应用0.1%结晶状的牛血清白蛋白溶液稀释。所用缓冲液最好新鲜配制,ABC试剂用玻璃瓶装的蒸馏水稀释,去离子水可能含过氧化酶抑制剂,能降低敏感性,不宜采用。具体步骤是:①新鲜组织冰冻切片后空气干燥或风干10min。②切片用丙酮或95%酒精固定10min后PBS冲洗3次,共10min。(也可先固定,后切片,再清洗)。③在0.3%H 2 O 2 甲醇中放置20min后PBS冲洗3次,每次5min。④用正常兔血清稀释孵育20min后,用滤纸吸取过多的血清,并擦干载片中组织周围的液体,但不能使组织干燥,并用彩色笔在组织周围圈画以防抗体液流失。⑤加鼠抗溶菌酶稀释抗血清,在室温下放置30min或在4 ℃ 过夜后BPS洗10min。⑥加生物素化的兔抗鼠血清稀释液,在室温下放置30min后PBS洗20min。⑦加稀释好的Vec-tastain Elite ABC试剂盒中的AB混合液(在使用前30min配好),再孵育30min,PBS洗10min。⑧组织切片在含0.1%DAB(1mg/ml)和0.02%H 2 O 2 的0.1mol/l pH7.6 Tris缓冲液中反应2~7min,自来水冲洗5min(在显微镜下观察结果,决定反应时间)后甲基绿或苏木精对比染色,脱水和封片,显微镜观察。
  四、结果判断
  溶菌酶主要分布在腺体细胞胞浆内,其中以潘氏细胞和杯状细胞中最明显,也可以分布在腔面或粘液中。炎性组织中粒性白细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润较多,也有明显着色。但是这些细胞多位于固有层内,即使个别细胞位于上皮层,其形态与腺体细胞不同,容易鉴别。当然,这些阳性细胞需与内源酶引起的着色相鉴别。

·溶菌酶的研究的临床意义

  溶菌酶的主要功能是能溶解细菌表面的糖蛋白,具有抗感染的作用。也有人认为能增加吞噬细胞作用,能与各种阴离子分子形成复合物。高浓度溶菌酶能改善细胞膜的功能。溶菌酶的研究包括组织中的分布和血清中含量测定。有人对不同病态胃粘膜进行研究,发现除正常幽门腺细胞能合成溶菌酶外,其它胃腺体细胞均无此功能。表浅性胃炎时,胃体胃窦的颈粘液细胞开始具有分泌溶菌酶的功能。肠化生腺体中的潘氏细胞、杯状细胞、不典型增生的腺体细胞也能产生溶菌酶。作者推测可能慢性胃炎时细菌等感染机会增多,是机体局部产生的对感染的调节 反应。有趣的是在胃癌细胞中也发现溶菌酶而且分化程度越高,分泌溶菌酶功能越强。转移性胃癌细胞和胃腺瘤细胞增色能分泌溶菌酶。其机理还不清楚。 有人对肠道进行研究,发现正常小肠粘膜杯状细胞和潘氏细胞能分泌溶菌酶,但含量较低。间质内粒性白细胞和巨噬细胞也有溶菌酶。但是,正常结肠和直肠上皮细胞表面和粘液腺体隐窝细胞中没有溶菌酶,固有层有溶菌酶阳性粒性白细胞。在15例溃疡性结肠炎病人中7例在结肠的直肠上皮细胞胞浆出现溶菌酶,8例克隆氏病人中只有1例阳性。作者认为用免疫细胞化学方法进行溶菌酶的定位研究有助于克隆氏病和溃疡性结肠炎病人的鉴别诊断。也有人对结肠癌进行研究,认为溶菌酶的分布与胃癌相反,结肠癌分化越高,分泌功能越低、其机理尚不清楚。 血清溶菌酶浓度的测定也曾作为无并发症的溃疡性结肠炎和活动性克隆氏病的鉴别诊断指标之一。由于80%以上血清溶菌酶多来源于粒性白细胞,不论溃疡性结肠炎或克隆氏病都可能引起周围血管局部粒性白细胞、单核细胞和巨噬细胞增多,因此,血清溶菌酶含量受到影响的因素较多,特异性不高,诊断价值有待进一步研究。

如何从蛋清中提取溶菌酶

  1、原料处理 新鲜或冰冻蛋清(或蛋壳水)70kg,用试纸测其pH值,应在8.0左右,经解冻后通过铅筛,除去蛋清中的脐带;蛋壳碎片及其他杂质。
  2、吸附 用冰水冷却并搅拌蛋清,使温度降到5℃,缓缓加入724树脂10kg,搅拌,使树脂完全悬浮在蛋清中。保持温度0-10℃,再继续搅拌5h。将蛋清移入冷库,在0-10℃静置过液。
  3、洗涤;洗脱 隔天把上层蛋清清液倾出,下层用清水洗去附着的蛋白质,先后共洗四次。最后将树脂抽滤去水分,用24kg0.15m磷酸缓冲液(pH6.5)分三次加入树脂搅拌,每次搅拌15min后抽滤去水分。然后用10%硫酸铵18kg,分4次洗脱溶菌酶。合并洗脱液,加入32%(重量、体积)固体硫酸铵使含量达40%,析出白色沉淀。在冷处放置过夜,过滤出沉淀。
  4、透析 将沉淀溶解于1.5l蒸馏水中,在冷库内透析24-36h,除去大部分硫酸铵。
  5、盐析 透析完毕,将溶液用滤纸过滤,得澄清透析液。用滴管慢慢加入氢氧化钠溶液,使pH上升到8.5-9.0,如有白色沉淀,应即离心除去。然后在搅拌下加入3N盐酸,使溶液pH为3.5。按体积缓缓加入5%固体氯化钠,生成白色沉淀。在0-10℃冷库放置48h,抽滤得到溶菌酶沉淀。
  6、干燥沉淀内加入10倍量0℃无水丙酮,搅拌使颗粒松细,在冷处静置数小时,滤去丙酮。沉淀用五氧化二磷真空干燥,即得口服或外用溶菌酶粉剂原料。如不用丙酮脱水,可将溶菌酶透析液冷冻干燥可得不含氯化钠的溶菌酶成品。按蛋清重量计,收率0.1%。