分光光度法

  
分光光度法
         分光光度法
分光光度法是通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度,对该物质进行定性和定量分析的方法。  在分光光度计中,将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时,便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。如以波长(λ)为横坐标,吸收强度(A)为纵坐标,就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法,称为分光光度法,也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色物质的方法,称为紫外分光光度法;用可见光光源测定有色物质的方法,称为可见光光度法。它们与比色法一样,都以Beer-Lambert定律为基础。 上述的紫外光区与可见光区是常用的。但分光光度法的应用光区包括紫外光区,可见光区,红外光区。  波长范围:  (1)200~400nm的紫外光区,  (2)400~760nm的可见光区,   (3)2.5~25μm(按波数计为4000cm<-1>~400cm<-1>)的红外光区。  

仪器

  紫外分光光度计,可见分光光度计(或比色计)、红外分光光度计或原子吸收分光光度计。为保证测量的精密度和准确度,所有仪器应按照国家计量检定规程或本附录规定,定期进行校正检定。

仪器的校正

  1.波长的准确度试验  以仪器显示的波长数值与单色光的实际波长值之间误差表示,应在±1.0nm范围内。  可用仪器中灯的486.02nm与656.10nm谱线进行校正。  2.吸收度的准确度试验  3.杂散光的试验  4.波长重现性试验  5.分辨率试验  

基本原理

  当一束强度为I0的单色光垂直照射某物质的溶液后,由于一部分光被体系吸收,因此透射光的强度降至I,则溶液的透光率T为:  根据朗伯(Lambert)-比尔(Beer)定律:  A=abc  式中A为吸光度,b为溶液层厚度(cm),c为溶液的浓度(g/dm^3), a为吸光系数。其中吸光系数与溶液的本性、温度以及波长等因素有关。溶液中其他组分(如溶剂等)对光的吸收可用空白液扣除。  由上式可知,当固定溶液层厚度l和吸光系数时,吸光度A与溶液的浓度成线性关系。在定量分析时,首先需要测定溶液对不同波长光的吸收情况(吸收光谱),从中确定最大吸收波长 ,然后以此波长的光为光源,测定一系列已知浓度c溶液的吸光度A,作出A~c工作曲线。在分析未知溶液时,根据测量的吸光度A,查工作曲线即可确定出相应的浓度。这便是分光光度法测量浓度的基本原理。  

使用范围

  凡具有芳香环或共轭双键结构的有机化合物,根据在特定吸收波长处所测得的吸收度,可用于药品的鉴别、纯度检查及含量测定。  

测定方法

·对照品比较法

  (1)按各品种项下的方法,分别配制供试品溶液和对照品溶液,对照品溶液中所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的100±10%,所用溶剂也应完全一致,在规定的波长测定供试品溶液和对照品溶液的吸收度后,按下式计算含量,即得。  (2)计算式                         A样×G对/稀释倍数×100×1  含量(%)= ————————————-- ×100%                         A对×G样/稀释倍数×100×1

·吸收系数法

  (1)按各品种项下的方法配制供试品溶液,在规定的波长处测定其吸收度,再以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量。用本法测定时,应注意仪器的校正和检定。  (2)计算式                                          A样  含量(%)= ——————————————- ×100%                 G样/稀释倍数×(E1%1cm)对×100×1

·计算分光光度法

  采用计算分光光度法应慎重。本法有多种,使用时均应按各品种项下规定的方法进行。当吸收度处在吸收曲线的陡然上升或下降的部位测定时,波长的微小变化可能对测定结果造成显著影响,故对照品和供试品测试条件应尽可能一致。若测定时不用对照品,如维生素A测定法,则应在测定时对仪器作仔细的校正和检定。  

注意事项

  1.空白溶液与供试品溶液必须澄清,不得有浑浊。如有浑浊,应预先过滤,并弃去初滤液。  2.测定时,除另有规定外,应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白对照,采用1cm的石英吸收池。
分光光度法
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  3.在规定的吸收峰波长±2nm以内测试几个点的吸收度,以核对供试品的吸收峰波长位置是否正确,除另有规定外,吸收峰波长应在该品种项下规定的波长±2nm以内;否则应考虑该试样的真伪、纯度以及仪器波长的准确度,并以吸收度最大的波长作为测定波长。  4.一般供试品溶液的吸收度读数,以在0.3~0.7之间的误差较小。  5.吸收池应选择配对,否则要引入测定误差。在规定波长下两个吸收池的透光率相差小于0.5%的吸收池作配对,在必要的情况时,须在最终测量扣除吸收池间的误差修正值。  6.由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收,因此测定供试品的吸收度后应减去空白读数,再计算含量。  7.仪器的接地必须良好,一切裸露的零件对地电位不得超过24伏(测电笔的氖管不得发亮)。  8.在使用过程中,如需开启试样室盖时或暂时停止测试时,必须及时推入光门钮杆(使光电管前光门关闭),保护光电管,以防止光电管受强光或长时间照射而损坏。  9.在测定时或改测其它检品时,应用待测溶液冲洗吸收池3~4次,用干净绸布或擦镜纸擦净吸收池的透光面至不留斑痕(切忌把透光面磨损)。  10.取吸收池时,应拿毛玻璃两面,切忌用手拿捏透光面,以免粘上油污。使用完后及时用测定溶剂冲净,再用纯化水冲净,用干净绸布或擦镜纸擦干,晾干后,放入吸收池盒中,防尘保存。  11.若吸收池内外壁沾污,两池差较大的处理。  (1)可用绸布缠在扁竹条外或用脱脂棉缠在细玻璃棒上蘸上乙醇,轻轻摩擦,再用纯化水冲净。  (2)如上述方法处理不好,必要时可用重铬酸钾-硫酸洗液泡洗1~2分钟,用自来水冲净,再用纯化水冲净。  (3)不得用毛刷刷洗或硬物拭擦,以防止表面光洁度受损影响正常使用。  12.请务必注意经常保持硅胶的干燥,目的是保护光学元件和光电放大器系统不致受潮损坏而影响仪器的正常工作,如发现有的硅胶由蓝色变为粉红色,应立即更换。该仪器干燥剂筒有两个:一个是装在放大器暗盒上,另一个装在单色光器暗盒上。  13.在更换硅胶干燥剂时,应关闭切断电源。  14.在停止工作期间,主机试样室内应放入袋装或筒装硅胶干燥剂。用防尘罩罩住整个仪器,并在防尘罩内放数袋防潮硅胶。  15.仪器在操作中,狭缝的宽度应从小逐渐开大。若狭缝过大,由于进入光电管的光能量强度过大,将会使放大器输出信号达到饱和,以至数字显示出溢出(即数字闪烁或示1不变)。这不是仪器有故障。  16.将波长旋转放在625nm,铗缝关闭在0.02nm附近,选择按键恢复在停止工作部位(即三个键均弹出)。  17.搬动仪器时应搬在主体端,不要搬在试样室和光电管盒端以及光源灯室部位,以防止仪器狭缝或光路部件受力而发生变形。并在搬动或运输时,应将可动部分固定,如各旋钮可用胶布贴住,狭缝位置开大些,然后固定,不要关小狭缝,以免运输时振动使狭缝刀口受损坏。  18.仪器的光栅、反射镜绝对不能擦拭,否则将损坏仪器光学表面,增加杂散光。  19.仪器经过搬动请及时检查并纠正波长精度,为保证测定的准确性请经常校准波长精度。如有异常,应立即报告质量保证部,但不得擅自调整,并及时做好记录。  

结果计算

                                                 A  E1%1cm(供试品) = ——                                                CL                        E1%1cm(供试品)  含量(%)= ——————————- ×100%                  E1%1cm(标准值或对照品)  

允许差

  仪器分析方法的误差限度,除另有规定外,其相对偏差应在±(2.0~3.0)%。